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CD19免疫組化IHC

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細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下:1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈:3min×3。4. 1%Triton:25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈:2×5 min。6. 羊血清封閉:37度,20分鐘。7. 一抗,4度過夜,一般要大于18小時或者37度,1-2小時。8. 4度PBS洗凈,3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,3×5 min。11. 涼干封片(封閉液PH8.5);不管采用何種方法,在使用PBS緩沖液漂洗時,都要漂洗干凈并且要測下pH值,可以使用PBS多清洗幾次,也可以延長PBS清洗時間,如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病。CD19免疫組化IHC

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直接免疫熒光:單抗體(一抗)用于免疫染色和檢測目標蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標抗原結(jié)合,并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點:由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比,時間縮短(操作步驟減少)。直接免疫熒光的缺點:不允許通過二抗進行信號放大;檢測靈敏度降低;熒光素結(jié)合一抗的選擇有限;與使用熒光二抗的檢測相比,更昂貴。間接免疫熒光:使用兩種抗體(一抗和二抗)進行免疫染色并檢測目標蛋白。首先,用特異性一抗標記目標蛋白。然后,熒光素結(jié)合的二抗(與一抗具有不同的物種反應(yīng)性)識別結(jié)合的抗原-抗體復合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合,熒光信號被放大,提供了更高的檢測靈敏度。N-cad免疫檢測免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,可以檢測非常低濃度的目標分子。

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免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)

細胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導,細胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標記技術(shù)相結(jié)合,原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,采用熒光標記,標記完成后,顯微鏡下觀察細胞內(nèi)某種抗原成分的多少,從而做出一個定位研究,也可以為細胞內(nèi)信號傳導提供一個明確的指導,細胞免疫熒光具有敏感性強、特異性高、速度快的特點,是目前比較常用的組織學技術(shù),也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,主要包括蛋白和一抗結(jié)合,其次是帶有熒光基團的二抗識別并結(jié)合一抗,熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,可以實現(xiàn)精確的免疫檢測。

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熒光的猝滅:熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅,這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復到基態(tài),所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍、堿性復紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復染,以減弱非特異性熒光本質(zhì),使特異熒光更突出顯示。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。CRT(Calreticulin)免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標分子,通過不同顏色的熒光染料進行標記。CD19免疫組化IHC

免疫熒光通透(目的是使抗體進入胞內(nèi)),0.5%TritonX-100(一種去垢劑,用PBS配制)室溫通透20min(針對胞內(nèi)抗原,若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟);除了TritonX-100,也可作為通透劑,并且固定后的樣品不需要通透。封閉(減少一抗和二抗與非特異位點進行結(jié)合),通透后用PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加山羊血清,室溫封閉30min。常用的封閉液包括:與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,一定要注意樣品的保濕,避免樣品的干燥,否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品,在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。CD19免疫組化IHC

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